十年前，张（Zhang）身处医学革命的前沿。作为瑞士祖格 CRISPR Therapeutics 公司最早聘请的科学家之一，她致力于将这一创新基因编辑工具应用于疾病治疗。然而，随着工作的深入，她发现许多计划——尤其是用健康基因副本替换完整缺陷基因——远比预想的复杂。
如今，情况已有所改变。目前在中国武汉大学的张及其团队正在开发一套快速发展的基因组重写工具包，旨在服务于治疗和基础研究。这些新方法有的基于 CRISPR-Cas9，有的则完全摆脱了该框架。正如加州拉霍亚 Scripps Research 的生物工程师 Shannon Miller 所言：“这是新技术的疯狂爆炸。”
尽管这些技术尚处早期阶段且各有优劣，但没有任何单一方法能像 CRISPR-Cas9 那样在简单 DNA 编辑任务中兼具简便性与多功能性。选择何种工具取决于需插入 DNA 的大小、基因组定位以及目标细胞类型。艾米·普勒（Amy Pooler）指出：“这不是一个适合所有人的方法。”
CRISPR 与碱基编辑的局限
CRISPR-Cas9 通过切断双链 DNA 来引入微小改变或消除基因功能，其结果依赖于细胞易出错的修复机制，往往导致不可预测的基因失活。相比之下，碱基编辑利用 CRISPR 机器精准修改单个 DNA“字母”，无需切断双链，但其极高的定制化要求限制了适用范围。
以 Stargardt 病为例，这种遗传性视力丧失疾病由 ABCA4 基因的 1,200 多种变异引发，其中约 750 种理论上可通过碱基编辑修正。若要覆盖所有变异，需开发数百种不同的疗法。“为单一患者开发一种药物是不现实的，”张表示，“如果能植入整个健康基因，至少可以用一种疗法覆盖一种遗传病。”
此外，研究人员希望利用大型基因插入赋予细胞新功能，例如让 CAR-T 细胞产生免疫刺激蛋白，或在肿瘤附近激活特定遗传开关。基础科学领域也希望通过操纵大型 DNA 片段构建更精确的人类疾病模型、复制代谢途径或合成染色体。
然而，传统 CRISPR-Cas9 在插入大片段时效率显著下降，通常仅适用于短于 2,000 个碱基对的片段，且在神经元等非分裂细胞中效果不佳。先导编辑（prime editing）虽能在不切断双链的情况下插入序列，但容量仅限几百个碱基。俄亥俄州立大学 Bin Liu 称：“这确实是该领域的一个瓶颈。”
新型整合策略：PASTE 与 evoCAST
为突破上述限制，研究人员开始结合 CRISPR 元件与其他酶类以接入大型 DNA 片段。哈佛医学院基因组工程师 Omar Abudayyeh 和 Jonathan Gootenberg 开发了名为 PASTE 的技术。该方法利用 Bxb1 血清整合酶将 DNA 插入特定位点，配合原始编辑引入的着陆平台（landing pad）、Cas9 蛋白及反转录酶实现精准插入。
Abudayyeh 和 Gootenberg 共同创立的 Tome Biosciences 公司已利用 PASTE 在食蟹猴（Macaca fascicularis）体内成功替换了涉及 B 型血友病的基因。数据显示，约一半的动物肝细胞在一次治疗后含有修正版本。但该过程复杂，需要修饰后的 Cas9 酶、着陆平台序列、反转录酶、整合酶、导向 RNA 及供体 DNA 等多重组件。由于复杂性叠加，虽然肝脏靶向效率达到 50%，但在其他器官的应用仍具挑战性。
另一种方法涉及移动 DNA 元素——转座子。哥伦比亚大学生化学家 Sam Sternberg 与 Broad Institute 化学生物学家 David Liu 等人开发的 evoCAST 系统，利用 CRISPR 相关转座酶（CAST），可在人体细胞中插入多达 15,000 个碱基对的 DNA，包括几个治疗相关的基因组位点。然而，部分 evoCAST 设计涉及 6 至 7 种蛋白质，超出了当前递送系统的承载能力。Sternberg 强调，当前的重点在于简化组件数量并探索新的递送方式。
重组工程与逆转移子
Shannon Miller 转向“重组工程”（recombineering），这是一种基于细菌基因组改写技术的策略。在不计入供体 DNA 的情况下，其系统核心组件约为 1,500 个碱基对，可封装进单个腺相关病毒（AAV）载体中。Miller 团队正致力于提高该系统在人类细胞中的效率。
另一类移动遗传元素 R2 逆转移子则展现出不同的潜力。它可以完全作为包装在脂质纳米颗粒中的 RNA 分子存在，能够携带比 AAV 更大的货物。不过，将逆转移子定向到不同基因组区域需要重新设计其 DNA 结合域，这比改变导向 RNA 更具挑战性。因此，研究人员通常倾向于将供体 DNA 整合到基因组中预先确定的“安全港”区域。
